熒光免疫為什麼要保濕

『壹』 熒光免疫分析的原理

作為免疫分析法的一種，FIA同樣存在兩種模式，即競爭型和夾心型。其中競爭型（以標記抗原的競爭型為例）的測定原理是基於未標記的抗原（Ag）和標記抗原（Ag-L）競爭結合有限的抗體（Ab）而實現的免疫分析法。檢測時，Ab和Ag-L的濃度是固定的。當未標記的Ag加到Ab和Ag-L的免疫混合物中後，Ag和Ab的結合使得Ag-L與Ab的免疫復合物的量減少。樣品中存在的Ag越多，Ab結合的Ag-L便越少，從Ab-Ag-L免疫復合物的減少或游離Ag-L的增加，可以定量測定出樣品中待測抗原的含量。其反應過程如下：Ag+Ag-L+Ab≒（Ag：Ab）+（Ag-L：Ab）
對夾心型免疫分析來說，其反應原理是在免疫反應的載體上固定過量的Ab，然後加入一定量的Ag，免疫反應後，再加入過量的標記抗體（Ab-L），以形成「三明治」式夾心免疫復梁山合物。樣品中存在的Ag越多，結合的Ab-L也越多，夾心免碼搏疫復合物的標記熒光信號就越強。反應過橡模中程如下：Ab+Ag≒Ab：Ag≒Ab：Ag：Ab-L。

『貳』 免疫熒光的技術特點

該技術的主要特點是：特異性強、敏感性高、速度快。主要缺點是：非特異性染色問題尚未完全解決，結果判定的客觀性不足，技術程序也還比較復雜。磨啟滾
熒光免疫法按反應體系及定量方法不同，還可進一步分做若干種。與放射免疫法相比，熒光免疫法無放射性污染，並且大多操作簡便，便於推廣。國外生產的TDM用試劑盒，有相當一部分即屬於此類，並且還有瞎余專供TDM熒光偏振免疫分析用的自動分析儀生產。
由於一般熒光測定中的本底較高等問題，熒光免疫技術用於定量測定有一定困難。新發展了幾種特殊的熒光免疫測定，與酶旁塵免疫測定和放射免疫分析一樣，在臨床檢驗中應用。

『叄』 細胞免疫熒光，求助

免疫熒光染色的主要原理是利用抗原抗體之間的特異性結合來顯示目的蛋遲歷白，主要包括蛋白和一抗結合，其次是帶有熒光基團的二抗識別並結合一抗，熒光顯微鏡下即可觀察到熒光。實驗步驟如下：
1、已轉染72h的細胞種於共聚焦專用培養皿里，冰PBS洗三遍，每次5分鍾。
2、 細胞半干時，覆蓋以4%冷的多聚甲醛固定15分鍾，避光。
3、吸去多聚甲醛後，用冰PBS洗三遍，每次5分鍾。
4、0.5%Triton X-100覆蓋細胞10分鍾，冰PBS洗三遍，每次5分鍾。
5、與二抗相同宿主的血清？進口胎牛血清室溫封閉30分鍾。
6、 配製一抗（SAB2104246-50UG, Sigma, USA）：SAB+FBS=1:200。
7、加入一抗覆蓋細胞，錫紙包裹4度避光過夜。
次日碼慶搜：
8、取出細胞復溫至室溫約1h。
9、冰1‰Tween洗兩次，每次5分鍾，於搖床。冰PBS洗一次，5分鍾，於搖床。
10、配製熒游標記二抗：Ab50598 Goat anti-rabbit IgG(H&L) TRITC，用PBS或FBS配製。濃度1:200
11、加入二抗，室溫孵育1小時(避光)。
12、 冰1‰Tween洗兩次，每次5分鍾，於搖床。冰PBS洗一次，5分鍾，於搖床。
13、DAPI染核，每皿1滴，完全覆蓋住細胞即可。
14、 冰1‰Tween洗兩次，每次5分鍾，於搖床。冰PBS洗一次，5分鍾，於搖床。
15、加入防熒光淬滅封片劑，避光。
16、上機confocol
建議：1.還是染完之後沒有封片前直接照一些，因為有的時候可能封片會出現問題，再想照反而沒有了，另外不要拖太長時間，熒光會淬滅的。2.熒光的片子一定要避光保存，保存的好的話，過一段時間仍然能照出很好的片子。3.二抗用之前一定離心，不然有的時候有那種沉澱，在片子上就是一個很大的非特異性熒光光點，非常難看。4.不管採用何種方法，在使用PBS緩沖液漂洗時，如果結果背景較高可以延差櫻長漂洗的次數和時間。

『肆』 免疫熒光的方法有什麼注意環節

• 1、冰凍切片制備：建議用新鮮組織，否則組織細胞內部結構破壞，易使抗原彌散。選用干凈鋒利的刀片、組織一定要冷凍適度等，防止裂片和脫片嚴重。

• 2、組織切片固定：切好片風干後立即用冰丙酮等固定液進行固定5-10min，尤其要較長時間保存的白片，一定要及時固定和適當保存。

• 3、血清封閉：為防止內源性非特異性蛋白抗原的結合，需要在一抗孵育前先用血清（與二抗來源一致）封閉，減弱背景著色。血清封閉的時間是可以調整的，一般10-30min。

• 4、一抗孵育條件：在免疫組化反應中最重要，包括孵育時間和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4℃、室溫、37℃，其中4℃效果最佳；孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關，一般37℃1-2h，而4℃過宿和從冰箱拿出後37℃復溫45min。具體條件還要摸索。

• 5、二抗孵育條件：二抗一般室溫或橡陪37℃立即觀察，若將標本放在聚乙烯塑料袋中4℃30min-1h，具體時間需要摸索，而濃度一般有工作液，若是濃縮液還要摸索濃度，切記要避光反應。但在免疫熒光中我們一般先把二抗濃度和孵育時間先定下，然後去摸索一抗濃度和孵育時間。最後，熒光素標記的二抗隨著保存時間的延長，可能後有大量的游離熒光素殘留，需要注意配製時小包裝和並進行適當的離心。

• 6、復染：目的是形成細胞輪廓，從而更好地對目標蛋白進行定位。一般常用DAPI復染。

• 7、封片：為了長期保存，我們一般用緩沖甘油等封片，此外還有專門的抗熒光萃滅封片液。避免產生氣泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液，然後一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對面的那個拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接觸到液體時為止；當發現液體接觸面在不斷彌散時，則可以緩慢降低另一拐角，這樣一般不會產生氣泡。

• 8、切片清洗：為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當地加強清洗（延長時間和增多次數）尤為重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育後的清洗均為5次*5min。注意：單獨沖洗，防止交叉反應造成污染。溫柔沖洗，防止切片的脫落。我喜歡用浸洗方式；沖洗的時間要足夠，才能徹底洗去結合的物質。PBS的pH和離子強度的使用和要求。這方面我有慘痛教訓，當時我買的抗體稀釋液偏酸，結果背景一片黃（未見特異性染色），建議pH在7.4-7.6濃度是0.01M。（中性及弱鹼性條件（pH7-8）有利於免疫復合物的形成，而酸性條件則有利於分解；低離子強度有利於免疫復合物的形成，而高離子旅如激強度則有利於分解）

• 9、拍照：有條件的話最好立即拍照，若不能及時拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和濕度。使用熒光顯微鏡注意嚴格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進行操作，不要隨意改變程序；應在暗室中進行檢查；防止紫外線對眼睛的損害，在調整光源時應戴上防護眼鏡；檢查拆襪時間每次以1~2h為宜，超過90min，超高壓汞燈發光強度逐漸下降，熒光減弱；標本受紫外線照射3~5min後，熒光也明顯減弱或褪色；激發光長時間的照射，會發生熒光的衰減和淬滅現象；所以最多不得超過2~3h；熒光顯微鏡光源壽命有限，標本應集中檢查，以節省時間，保護光源。天熱時，應加電扇散熱降溫，新換燈泡應從開始就記錄使用時間。燈熄滅後欲再啟用時，須待燈光充分冷卻後才能點燃。一天中應避免數次點燃光源。關閉汞燈至少在開啟15-30分鍾後；標本染色後立即觀察，因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時間，防止封裱劑蒸發；使用的玻片等載體，都必須厚度均勻，無明顯的自發熒光，如果使用油鏡，還必須保證鏡油為無熒光鏡油；電源最好裝穩壓器，否則電壓不穩不僅會降低汞燈的壽命，也會影響鏡檢的效果。

『伍』 如何做好免疫熒光

• 免疫熒光是標記免疫技術發展最早的一種，它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術，通過將抗體與一些示蹤物質結合，利用抗原抗體反應進行組織或細胞內抗原物質的定位。免疫熒光步驟包括，細胞固定和通透，封閉，孵育一抗，二抗等。除了這些基本步驟，以下斗前建議可以幫助您獲得更好的實驗結果。

• 
  1、細胞固定和通透

• 為達到最佳的檢測效果，細胞需要經過固大激定和通透。這些步驟非常關鍵，細胞和抗原需要保證最佳的結構，並利於抗體與抗原結合。通常情況下，需要通過以下步驟得以實現：細胞用2%-4%多聚甲醛固定，之後用0.1%皂角苷或0.02%的Triton X-100進行通透。前者是比較溫柔的處理，但是對於核內抗原可能無效，需要用到Triton。使用皂角苷進行通透時，要注意它會引起細胞膜的可逆性通透，也就是除了在通透初期，在每個抗體孵育環節都需要進行通透。另外，細胞可以用冰甲醇進行同時固定和通透，可以避免去垢劑的使用。

• 2、抗體特異性
  

• 免疫熒光需要用到特異性非常強的抗體，可以避免高背景和不理想的蛋白定位結果。在空仿清大多數情況下，純化抗體的效果很好，但是正確的對照可以幫助精準定位抗原。使用只有二抗染色的片子作為陰性對照，有利於減少降低背景干擾。

• 3、合適的抗體稀釋比例
  

• 通過優化抗體稀釋比例來優化染色，通常情況下1ug/ml的純化抗體或者1:100-1:1000的抗血清足夠達到特異性染色的結果。但在能保證低背景染色的前提下，可以通過增加濃度來提高信號強度。如果是第一次使用該抗體或測定某抗原，強烈建議濃度梯度實驗。

• 4、優化緩沖液和封閉劑
  

• 盡管很多抗原在常見的Buffer如PBS中可以很好的被染色，但是對於某些目的抗原，更換一下含有不同離子的緩沖液，比如鈣、鎂、鉀等，可以帶來很大程度上的改善。Rockland可提供優化過的IHC用封閉緩沖液，同樣適用於熒光染色實驗。

• 5、選擇正確的二抗
  

• 如果您需要做免疫實驗，我們強烈建議您選擇進行過預吸附的二抗進行單染實驗；如果是雙重甚至是多重染色，那麼必須使用預吸附的二抗。同時，請優先選擇來自同一物種的二抗。

• 6、使用合適的細胞密度
  

• 選擇合適的細胞數量進行染色，當細胞數量過多時，細胞結構不好，導致染色背景深，低細胞密度，會使細胞貼壁不佳，狀態不好。

• 7、多重染色
  

• 對同一樣本進行兩個不同抗原的檢測時，可以用各自的抗體進行同時染色，但要求兩個一抗的種屬來源不同，標記物不同，而二抗的種屬來源需保持一致。

• 8、降低背景
  

• 高背景是免疫熒光常見的問題，解決此問題可以用二抗來源的正常血清代替BSA做封閉液，降低抗體濃度，增加洗滌次數，洗滌至少三次，每次五分鍾，推薦洗滌液為PBS+0.05%Tween。

• 9、封片
  

• 作為免疫熒光的最後一步，可以提高折射率，保護樣品。

• 10、數據分析
  

• 觀察整體樣片時，選擇具有代表性的細胞進行數據獲取與分析。

  
  

『陸』 免疫熒光原理

免疫學的基本反應是抗原-抗體反應。由乎氏於抗原抗體反應具有高度的特異性，所以當抗原抗體發生反應時，只要知道其中的一個因素，就可以查出另一個因素。免疫熒光技術就是將不影響抗原抗體活性的好友熒光色素標記在抗體（或抗原）上，與其相應的抗原（或抗體）結合後，在熒光顯微鏡友頃槐下呈現一種特異性熒光反應。

『柒』 熒光抗體技術簡介

目錄

• 1 拼音
• 2 英文參考
• 3 概述
• 4 熒光現象
• 4.1 熒光的產生
• 4.2 熒光效率
• 4.3 熒光的猝滅
• 5 熒光物質
• 5.1 熒光色素
• 5.2 其他熒光物質
• 6 熒光抗體的制備
• 6.1 抗體的熒光素標記
• 6.2 熒光抗體的鑒定
• 7 免疫熒光顯微技術
• 7.1 標本的製作
• 7.2 熒光抗體染色
• 7.3 熒光顯微鏡檢查
• 7.4 實驗的類型
• 8 熒光抗體技術在醫學檢驗中的應用

1 拼音

yíng guāng kàng tǐ jì shù

2 英文參考

fluorescentantibodytechnique

3 概述

Coons等於1941年首次採用熒光素進行標記而獲得成功。這種以熒光物質標記抗體而進行抗原定位的技術稱為熒光抗體技術（fluorescentantibodytechnique）。熒光免疫技術是標記免疫技術中發展最早的一種。很早以來就有一些學者試圖將抗體分子與一些示蹤物質結合，利用抗原抗體反應進行組織或細胞內抗原物質的定位。

由於一般熒光測定中的本底較高等問題，熒光免疫技術用於定量測定有一定困難。近年來發展了幾種特殊的熒光免疫測定，與酶免疫測定和放射免疫分析一樣，在臨床檢驗中應用。

4 熒光現象

4.1 熒光的產生

一此化學物質能從外界吸收並儲存能量（如光能鄭睜、化學能等）而進入激發態，當其從激發態再回復到基態時，過剩的能量可以電磁輻射的形式放射（即發光）。

熒光發射的特點是：可產生熒光的分子或原子在接受能量後即刻引起發光；而一旦停止供能，發光（熒光）現象也隨之在瞬間內消失。

可以引起發熒光的能量種類很多，由光激發所引起的熒光稱為致熒光。由化學應所引起的稱為化學熒光，由X線或陰極射線引起的分別稱為X線熒光或陰極射線熒光。熒光免疫技術一般應用致熒光物質進行標記。

4.2 熒光效率

熒光分子不會將全部吸收的光能都轉變成熒光，總或多或少地以其他形式釋放。熒光效率是指熒光分子將吸收的光能轉變成熒光的百分率，與發射熒光光量子的數值成正比。

熒光效率＝發射熒光的光量分子數（熒光強度）／吸收光的光量子數（激發光強度）

發射熒光的光量子數亦即熒光強度，除受激發光強度影響外，也與激發光的波長有關。各個熒光分子有其特定的吸收光譜和發射光譜（熒光光譜），即在某一特定波長處有最大吸收峰和最大發射峰。選擇激發光波長量接近於熒光分子的最大吸收峰波長，且測定光波量接近於最大發射光波峰時，得到的熒光強度也最大。

4.3 熒光的猝滅

熒光分子的輻射能力在受到激發光較長時間的照射後會減弱甚至猝滅，這是由於激發態分子的電子不能回復到基態，所吸收的能量無法以熒光的形式發射。一些化合物有天然的熒光猝滅作用而被用作猝滅劑，以消除不需用的熒光。因此熒光物質的保存應注意避免光（特別是紫外光）的直接照射和與其他化合物的接觸。在熒光抗體技術中常用一些非熒的色素物質如亞甲藍、堿性復紅。伊文思藍或低濃度的過錳酸鉀、碘溶液等對標本進行得當復染，以減弱非特異性熒光本質，使特異熒光更突出顯示。

5 熒光物質

5.1 熒光色素

許多物質都可產生熒光現象，但並非都可用作熒光色素。只有那些能產生明顯的熒光並能作簡叢侍為染料使用的有機化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有：

1．異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）為黃色或橙黃色結晶粉末，易溶於水或酒精等溶劑。分子量為389.4，最大吸收光波長為490495nm，最大發射光波長520530nm，呈現明亮的黃綠色熒光，結構式如下：

有兩種同分異結構，其中異構體Ⅰ型在效率、穩定性、與蛋白質結合能力等方面都更好，在冷暗乾燥處可保存多年，是應用最廣泛的熒光素。其主要優點是：①人眼對黃綠色較為敏感，②通常切片標本中的綠色熒光少於紅色。

2．四乙基羅丹明（rhodamine，RIB200）為橘紅色粉末，不溶於水，易溶於酒精和丙酮。性質穩定，可長期保存。結構式如下：

最大吸攔吵收光波長為570nm，最大發射光波長為595～600nm，呈橘紅色熒光。

3．四甲基異硫氰酸羅丹明（，TRITC）結構式如下：

最大吸引光波長為550nm，最大發射光波長為620nm，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對比鮮明，可配合用於雙重標記或對比染色。其異硫氰基可與蛋白質結合，但熒光效率較低。

5.2 其他熒光物質

1．酶作用後產生熒光的物質某些化合物本身無熒光效應，一旦經酶作用便形成具有強熒光的物質。例如4甲基傘酮βD半乳糖苷受β半乳糖苷酶的作用分解成4甲基傘酮，後者可發出熒光，激發光波長為360nm，發射光波長為450nm。其他如堿性酸酶的底物4甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基苯乙酸等。

2．鑭系螯合物某些3價稀土鑭系元素如銪（Eu3+）、鋱（Tb3+）、鈰（Ce3+）等的螯合物經激發後也可發射特徵性的熒光，其中以Eu3+應用最廣。Eu3+螯合物的激發光波長范圍寬，發射光波長范圍窄，熒光衰變時間長，最適合用於分辨熒光免疫測定。

6 熒光抗體的制備

6.1 抗體的熒光素標記

用於標記的抗體，要求是高特異性和高親和力的。所用抗血清中不應含有針對標本中正常組織的抗體。一般需經純化提取IgG後再作標記。作為標記的熒光素應符合以下要求：①應具有能與蛋白質分子形成共價健的化學基團，與蛋白質結合後不易解離，而未結合的色素及其降解產物易於清除。②熒光效率高，與蛋白質結合後，仍能保持較高的熒光效率。③熒光色澤與背景組織的色澤對比鮮明。④與蛋白質結合後不影響蛋白質原有的生化與免疫性質。⑤標記方法簡單、安全無毒。⑥與蛋白質的結合物穩定，易於保存。

常用的標記蛋白質的方法有攪拌法和透析法兩種。以FITC標記為例，攪拌標記法為：先將待標記的蛋白質溶液用0.5ml/LpH9.0的碳酸鹽緩沖液平衡，隨後在磁力攪拌下逐滴加入FITC溶液，在室溫持續攪拌4～6h後，離心，上清即為標記物。此法適用於標記體積較大，蛋白含量較高的抗體溶液。優點是標記時間短，熒光素用量少。但本法的影響因素多，若操作不當會引起較台強的非特異性熒光染色。

透析法適用於標記樣品量少，蛋白含量低的抗體溶液。此法標記比較均勻，非特異染色也較低。方法為：先將待標記的蛋白質溶液裝入透析袋中，置於含FITC的0.01mol/LpH9.4碳酸鹽緩沖液中反應過夜，以後再對PBS透析法去除游離色素。低速離心，取上清。

標記完成後，還應對標記抗體進一步純化以去除未結合的游離熒光素和過多結合熒光素的抗體。純化方法可採用透析法或層析分離法。

6.2 熒光抗體的鑒定

熒光抗體在使用前應加以鑒定。鑒定指標記包括效價及熒光素與蛋白質的結合比率。抗體效價可以用瓊脂雙擴散法進行滴定，效價大於1:16者較為理想。熒光素與蛋白質結合比率（F/P）的測定和計算的基本方法是：將制備的熒光抗體稀釋至A2801≈1.0，分別測讀A280（蛋白質特異吸收峰）和標記熒光素的特異吸收峰，按公式計算。

F/P值越高，說明抗體分子上結合的熒光素越多，反之則越少。一般用於固定標本的熒光抗體以F/P＝1.5為宜，用於活細胞染色的以F/P＝2.4為宜。

抗體工作濃度的確定方法類似ELISA間接法中酶標抗體的滴定。將熒光抗體自1:4～1:256倍比稀釋，對切片標本作熒光抗體染色。以能清晰顯示特異熒光、且非特異染色弱的最高稀釋度為熒光抗體工作濃度。

熒光抗體的保存應注意防止抗體失活和防止熒光猝滅。最好小量分裝，－20℃凍存，這樣就可放置3～4年。在4℃中一般也可存放1～2年。

7 免疫熒光顯微技術

免疫熒顯微技術的基本原理是：使熒光抗體與標本切片中組織或細胞表面的抗原進行反應，洗滌除去游離的熒光抗體後，於熒光顯微鏡下觀察，在黑暗背景上可見明亮的特異熒光。

7.1 標本的製作

熒光顯微技術主要靠觀察切片標本上熒光抗體的染色結果作為抗原的鑒定和定位。因此標本製作的好壞直接影響到檢測的結果。在製作標本過程中應力求保持抗原的完整性，並在染色、洗滌和封埋過程中不發生溶解和變性，也不擴散至臨近細胞或組織間隙中去。標本切片要求盡量薄些，以利抗原抗體接觸和鏡檢。標本中干擾抗原抗體反應的物質要充分洗去，有傳染性的標本要注意安全。

常見的臨床標本主要有組織、細胞和細菌三大類。按不同標本可製作塗片、印片或切片。組織材料可制備成石蠟切片或冷凍切片。石蠟切片因操作煩瑣，結果不穩定，非特異反應強等已少應用。組織標本也可製成印片，方法是用洗凈的玻片輕壓組織切面，使玻片粘上1～2層組織細胞。細胞或細菌可製成塗片，塗片應薄而均勻。塗片或印片製成後應迅速吹乾、封裝。置－10℃保存或立即使用。

7.2 熒光抗體染色

於已固定的標本上滴加經適當稀釋的熒光抗體。置濕盒內，在一定溫度下溫育一定時間，一般可用25～37℃30min，不耐熱抗原的檢測則以4℃過夜為宜。用PBS充分洗滌，乾燥。

7.3 熒光顯微鏡檢查

經熒光抗體染色的標本，需要在熒光顯微鏡下觀察。最好在染色當天即作鏡檢，以防熒光消退，影響結果。

熒光顯微鏡檢查應在通風良好的暗室內進行。首先要選擇好光源或濾光片。濾光片的正確選擇是獲得良好熒光觀察效果的重要條件。在光源前面的一組激發濾光片，其作用是提供合適的激發光。激發濾光片有兩種。MG為紫外光濾片，只允許波長275～400nm的紫外光通過，最大透光度在365nm；BG為藍紫外光濾片，只允許波長325～500nm的藍外光通過，最大透光度為410nm。靠近目鏡的一組阻擋濾光片（又稱吸收濾光片或抑制濾光片）的作用是濾除激發光，只允許熒光通過。透光范圍為410～650nm，代號有OG（橙黃色）和GG（淡綠黃色）兩種。觀察FITC標記物可選用激發濾光片BG12，配以吸收濾光片OG4或GG9。觀察RB200標記物時，可選用BG12與OG5配合。

7.4 實驗的類型

1．直接法用特異熒光抗體直接滴加於標本上，使之與抗原發生特異性結合（圖171）。本法操作簡便，特異性高，非特異熒光染色因素少；缺點是敏感度偏低，每檢查一種抗原需制備相應的特異熒光抗體。

圖171 直接免疫熒光法原理示意圖

2．間接法可用於檢測抗原和抗體，原理見圖172。本法有兩種抗體相繼作用，第一抗體為針對抗原的特異抗體，第二抗體（熒光抗體）為針對第一抗體的抗抗體。本法靈敏度高，而且在不同抗原的檢測中只需應用一種熒光抗體。

圖172 間接免疫熒光法原理示意圖

圖173 補體結合免疫熒光法原理示意圖

3．補體結合法本法是間接法的第一步抗原抗體反應時加入補體（多用豚鼠補體），再用熒游標記的抗補體抗體進行示蹤（圖173）。本法敏感度高，且只需一種抗體。但易出現非特異性染色，加之補體不穩定，每次需采新鮮豚鼠血清，操作復雜。因此較少應用。

4．標記法本法用FITC及羅丹明分別標記不同的抗體，而對同一標本作熒光染色。在有兩種相應抗原存在時，可同時見到橙紅和黃綠兩種熒光色澤。

8 熒光抗體技術在醫學檢驗中的應用

熒光抗體技術在臨床檢驗上已用作細菌、病毒和寄生蟲的檢驗及自身免疫病的診斷等。在細菌學檢驗中主要用於菌種的鑒定。標本材料可以是培養物、感染組織、病人分泌排泄物等。本法較其他鑒定細菌的血清學方法速度快、操作簡單、敏感性高，但在細菌實驗診斷中，一般只能作為一種補充手段使用，而不能代替常規診斷。熒光抗體染色法對腦膜炎奈氏菌、痢疾志賀菌、霍亂弧菌、布氏桿菌和炭疽桿菌等的實驗診斷有較好效果。熒光間接染色法測定血清中的抗體，可用於流行病學調查和臨床回顧診斷。免疫熒光用於梅毒螺旋體抗體的檢測是梅毒特異性診斷常用方法之一。免疫熒光技術在病毒學檢驗中有重要意義，因為普通光學顯微鏡看不到病毒，用熒光抗體染色法可檢出病毒及其繁殖情況。

在寄生蟲感染診斷中，間接熒光抗體染色法有非常廣泛的應用。間接免疫熒光試驗（IFAT）是當前公認的最有效的檢測瘧疾抗體的方法。常用抗原為瘧疾患者血液中紅內期裂殖體抗原。IFAT對腸外阿米巴、尤其是阿米巴肝膿腫也有很高的診斷價值，所用抗原是阿米巴培養物懸液或提取的可溶性抗原。

免疫熒光法還是檢測自身抗體的好工具，在自身免疫病的實驗診斷中應用廣泛。其突出優點是能以簡單方法同時檢測抗體和與抗體起特異反應的組織成分，並能在同一組織中同時檢查抗不同組織成分的抗體。主要有抗核抗體、抗平滑肌抗體和抗線粒體抗體等。抗核抗體的檢測最常採用鼠肝作核抗原，可做成冰凍切片、印片或勻漿。用組織培養細胞如Hep2細胞或Hela細胞塗片還可檢出抗著絲點抗體、抗中性粒細胞漿抗體等。應用免疫熒光技術可以檢出的其他自身抗體有抗（胃）壁細胞抗體、抗雙鏈DNA抗體、抗甲狀腺球蛋白抗體、抗甲狀腺微粒體抗體、抗骨髓肌抗體及抗腎上腺抗體等。

『捌』 求教一些生物實驗方面的問題，熒光免疫層析技術的原理

熒光免疫層析技術的原理
免疫層析技術就是根據免疫抗體-抗原的相互吸附原理設計出的一種制備收集或檢測分析的色譜技術。一般情況就是將已知抗體或抗轎灶耐原歐聯到微球或介質上，使樣品通過，能夠與介質上抗原或抗體吸附的相應分子會被吸附在介質上，之後進行沖辯喊洗，洗脫即可得到希閉春望獲得的物質。檢測的原理和收集類似，只是加入檢測部分，一般和ELISA相似。

『玖』 全自動化學發光免疫分析儀為什麼要洗滌

免疫分析經歷了放射免疫檢驗、熒光免疫檢驗、酶標免疫檢驗等不同時期，全自動化學發光免疫檢驗是免疫分析發展困世的一個新階段，它環保、快速、准確的特點已得到人們的普遍認識。因此全自動化學發光免疫分汪激肢析是通往免疫檢驗完美境界的必鉛檔經之路。

『拾』 免疫熒光的簡介

免疫熒光（immunofluorescence technic）
Coons等於1941年首次採用亮基斗熒光素進行標記而獲得成功。這種以熒光物質標記抗體而進行抗原定位的技術稱為熒光抗體技術（fluorescentantibodytechnique）。用熒光抗體示蹤或檢查相應抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光抗原標記物示蹤或檢查相應抗體的方法稱熒光抗原法。這兩敬磨種方法總稱免疫鋒搭熒光技術，因為熒光色素不但能與抗體球蛋白結合，用於檢測或定位各種抗原，也可以與其他蛋白質結合，用於檢測或定位抗體，但是在實際工作中熒光抗原技術很少應用，所以人們習慣稱為熒光抗體技術，或稱為免疫熒光技術。以熒光抗體方法較常用。 用免疫熒光技術顯示和檢查細胞或組織內抗原或半抗原物質等方法稱為免疫熒光細胞（或組織）化學技術。